Podstawowe wskazówki dotyczące kriokonserwacji kultur komórkowych

Podstawowe wskazówki dotyczące kriokonserwacji kultur komórkowych

Komórki kontynuują metabolizm podczas normalnych działań wzrostowych, co wymaga udziału różnych proteaz. Gdy temperatura spadnie poniżej -70 ° C, proteazy przestają działać. Dlatego w środowisku o wyjątkowo niskich temperaturach komórki mogą powstrzymać ich aktywność metaboliczną i wejść w stan uśpienia, który umożliwia długotrwałe przechowywanie.

1. Materiały eksperymentalne

Materiał bazowy:

Podstawowe medium hodowlane

Surowica (konwencjonalne FBS/NBS)

Ultrare Workbench

Sterylny dimetylosulfotlenk (DMSO)

Sterylny roztwór soli w buforze fosforanowym PBS

Pistolet pipetowy

Elektryczna pistolet do pipet

Przygotowanie eksperymentów

A) Przygotowanie rozwiązania zamrażania:

Komórki ogólne: 55% pożywki podstawowej + 40% surowicy bydlęcej (FBS/NBS) + 5% DMSO

Komórki witalne: 90% surowica bydła (FBS/NBS) + 10% DMSO

Aliquot przygotowany roztwór kriokonserwacyjny do 15 ml rurki wirówki [Nest] i przechowuj w 4 ° C do późniejszego zastosowania.

(b) Przygotowanie komórek do zamrożonych:

Przed zamrożeniem komórek wybierz komórki o dobrym stanie wzrostu i w fazie logarytmicznej wzrostu i zastąp je świeżą średnim 12-24 godzinami przed zamrożeniem w celu utrzymania stanu komórek.

2. Procedura eksperymentalna

1. Obserwuj zamrożoną gęstość komórek, która wynosi około 80%~ 90%. Użyj pistoletu pipety, aby aspirować starą pożywkę, dodaj sterylne PBS do mycia komórek 1-2 razy i usuń pozostałe pożywkę w środowisku hodowli.

2. Dodaj odpowiednią ilość trypsyny lub soku trawiennego, aby umożliwić trypsynę wejść do komórek, i umieść je w inkubatorze do trawienia. Obserwuj stan komórek pod mikroskopem: cytoplazma się cofa, a komórki nie są już połączone z arkuszami. W tym momencie dodaj rozwiązanie Stop, aby zatrzymać proces trawienia.

3. Delikatnie bulgotaj komórki końcówką, aby utworzyć zawiesinę komórkową i odwirować zawiesinę komórkową przy 1000 rpm przez 3-5 minut.

Odrzuć supernatant, dodaj odpowiednią ilość roztworu zamrażania i delikatnie pipetę, aby komórki liczą się równomiernie. Dostosuj gęstość komórek za pomocą pożywki kriokonserwacyjnej, aby gęstość końcowa 5 × 106/ml ~ 1 × 107/ml.

4. Użyj pistoletu pipetowego, aby oddzielić rurki kriogeniczne zgodnie z oczekiwaną pojemnością, i użyj automatycznej maszyny do ograniczenia do zakrętki i uszczelnienia.

5. Standardowy program kriokonserwacji to szybkość chłodzenia od -1 ° C do -2 ° C/min, a komórki zamrożone można stopniowo zamrozić zgodnie z następującymi krokami: temperatura pokojowa → 4 ° C (20 minut) → - - 20 ° C (30 minut) → -80 ° C ° C (przez noc) → Długoterminowe magazynowanie w ciekłym azocie.

Można go również przechowywać bezpośrednio w zamrażarce w -80 ° C przez noc, a następnie przenieść do ciekłego azotu w celu przechowywania.

Yongyue Medical to zaawansowane technologicznie przedsiębiorstwo specjalizujące się w badaniach i rozwoju, produkcji i sprzedaży biomedycznych materiałów eksploatacyjnych. Wskazówki pipetów, pipety, płyta PCR, produkty hodowli komórkowej i inne biologiczne materiały eksploatacyjne laboratoryjne. Yongyue Medical jest godny twojego zaufania i wyboru! Witamy, aby skonsultować się!